DNA-vicrivelado

El Vikipedio, la libera enciklopedio
Saltu al: navigado, serĉo

DNA-vicrivelado estas fajna karakterizo de geno bezonigas ties sinsekvo-rivelon, tio estas koni la kvanton, la naturon kaj la vicordon de la nukleotidoj kiuj konsistigas ĝin. Koni la situon de nukleotidoj ebligas ekzemple koni la diversajn tranĉejojn por pli bone manipuli ilin. Fine, la en-silicia (perkomputila) tradukado de la nukleotida sinsekvo en aminoacidan sinsekvon ebligas eventuale konfirmi aŭ proponi funkcion por la proteino kodata de la geno.

Pluraj DNA-vicrivelaj teknikoj ekzistas, sed ni nur priskribos ĉi tie la principon de enzima vicrivelado per enkorpigo de dudeoksinukleotidoj. La dudeoksinukleotidoj (ddNTP) estas modifitaj deoksinukleotidoj kiuj kapablas integriĝi en sinteziĝantan DNA-fadenon, sed malebligante la enkorpigon de normale poste sekvanta nukleotido. Alidirite, la enkorpigo de ddNTP blokas la daŭrigon de DNA-plilongiga procezo.

Principo[redakti | redakti fonton]

Baza DNA-vicrivela principo: ddNTP blokas la plilongiĝon de DNA rezultante el apero de diverslongaj fragmentoj kiujn eblas disigi kaj ordigi por riveli la tutan sinsekvon.

Nukleotida prajmilo estas hibridita kun la unufadena DNA-fragmento kies sinsekvon oni volas determini. Ekde la 3'-OH finaĵo de la prajmilo, DNA-polimerazo sintezas la DNA-fadenon komplementan al la DNA-matrico ĉeeste de deoksiribonukleotidoj. Unu el la deoksiribonukleotido devas esti markita (ĉu radioaktive, ĉu fluoreske). La miksaĵo estas poste kvaronigita en 4 tubojn markitajn A, C, T kaj G. Ĉiu el tiuj tuboj enhavas, krom la 4 tipojn de dNTP, la ddNTP-n korespondantan (ddATP aŭ ddCTP aŭ ddGTP aŭ ddTTP). En ĉiu tubo, la aldonita ddNTP estas enkorpigita en la plilongiĝantajn fragmentojn.

Ĉiufoje ke ddNTP estas enkorpigita ĉe iu pozicio, la faden-plilongiĝado haltas ĉe tiu punkto kaj tiel estiĝas aro da molekuloj kun malsamaj longecoj, sed ĉiuj finiĝantaj per la sama ddNTP por unu aparta tubo. Se la dNTP kaj la ddNTP korespondanta aldoniĝas je adekvataj kvantoj, ĉiuj DNA-fragmentoj ĵuse sintezitaj kaj finiĝantaj per tiu ddNTP estos reprezentitaj. La enhavo de la 4 tuboj A, C, T kaj G estas sekve analizita per elektroforezo en akrilamida ĝelo je denaturigaj kondiĉoj (aŭ per har-dika elektroforezilo). La nove sintezitaj diversaj markitaj fragmentoj migras laŭ sia longeco kaj disiĝas laŭ sia nukleotid-nombro. Memradiografio (se uzo de radioaktive markitaj nukleotidoj) aŭ rivelo per fluoresko (se uzo de fluoreskaj nukleotidoj) estas realigita post migrado de la molekuloj en la ĝelo. La sinsekvo 5'-P->3'-OH de la nove sintezita fadeno legiĝas de malsupre supren, komparante la relativajn poziciojn de la bandoj en la 4 migrotrakoj.

Aŭtomata vicrivelado[redakti | redakti fonton]

Dum tiuj analizoj, la ĝel-legado kaj daten-akirado estas aŭtomataj. Tiukaze, la molekul-markadon oni faras per fluoreskaj markiloj. Dum la ĝel-migrado, la samploj detektiĝas je ties eliro pere de lasero kiu identigas la markitan molekulon. Novaj sistemoj funkciantaj surbaze de hardika elektroforezil-uzado ebligas pli bonan aŭtomatigon de la sistemo: samploj estas preparitaj mane kaj deponitaj en aŭtomatan ŝarĝilon. La aparato aŭtomate elprenas la samplon kaj lokas ĝin en la hardikan tubon. Ne plu necesas prepari akrilamidajn ĝelojn. La aŭtomataj vicriveliloj povas ene de kelkaj horoj analizi ĝis 96 samplojn. La aŭtomatigo ankaŭ povas koncerni vicrivelan reakcion kiun oni pli kaj pli ofte faras per robotoj kuplitaj kun PĈR-maŝinoj.

Fluoreska prajmilo[redakti | redakti fonton]

DNA-vicrivelo per la tekniko de la fluoreska prajmilo

En la metodo tiel nomita fluoreska prajmilo la uzita prajmilo en la vicrivela reakcio estas markita per fluoreskenzo. La reakcio estas farita en 4 apartaj tuboj, ĉiu enhavanta la prajmilon kuplitan kun fluoreskenzo ĉeeste de aparta korespondanta ddNTP. La DNA-polimerazo uzata por la reakcio estas termostabila kaj la polimerigado okazas en PĉR-maŝino per 3-etapaj cikloj:

  • denaturo
  • hibridigo
  • plilongigo

Reakcifine, la denaturitaj DNA-fragmentoj estas disigitaj per migrigo en plur-akrilamida ĝelo aŭ en hardika elektroforeza matrico. La DNA-fragmentoj aŭtomate analiziĝas elire de la ĝelo per laser-sistemo kiu ebligas identigi la fluoreskenzon. La rezultoj estas enkomputiligitaj kaj bitprogramo ebligas elkomputi kromatografion korespondantan al la sinsekvo.

Fluoreska finilo[redakti | redakti fonton]

DNA-vicrivelo per la tekniko de la fluoreska finilo

En la metodo tiel nomita fluoreska finilo, ddNTP estas ĉiuj markitaj per specifa fluoreskenzo. Ĉio okazas laŭ la sama principo kiel pri la Fluoreska prajmilo-metodo krom ke la reakcio okazas en ununura tubo. La avantaĝo de tiu metodo Fluoreska finilo estas ke oni povas uzi kiun ajn prajmilon por la vicrivela reakcio. Eblas do vicriveli longan klonitan DNA-fragmenton elektante la postan prajmilon konsiderante la reakcifinon de la antaŭa sinsekvo. Tiu metodo nun estas la plej uzata.

Eksteraj ligiloj[redakti | redakti fonton]

Pri uzo de "enz" en fluoreskenzo: http://bertilow.com/pmeg/vortfarado/neoficialaj_afiksoj/sufiksoj/enz.html?a=bk